SYTO 9/PI 活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

（SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit）是一款方便且操作簡(jiǎn)單的試劑盒，利用SYTO 9綠色核酸染料和碘化丙啶（PI）紅色熒光核酸染料來(lái)進(jìn)行細(xì)菌活力的檢測(cè)，適用于大量的細(xì)菌種屬，包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝桿菌、綠膿桿菌、Staphylococcus aureus、奧拉尼堡沙門氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和化膿性鏈球菌。

SYTO 9/PI 活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒的工作原理在于：SYTO 9和PI的光譜特征以及穿透健康細(xì)菌細(xì)胞的能力不同。單獨(dú)使用時(shí)，SYTO 9能對(duì)群體內(nèi)的所有細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記—具有完整膜和受損膜的細(xì)菌；相反，PI只能滲透進(jìn)入受損的膜，PI的插入會(huì)引起SYTO 9染色熒光的降低，當(dāng)體系內(nèi)加入兩種染料時(shí)。因此，通過(guò)適量比例的SYTO 9和PI的混合染色，具有完整膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌呈綠色熒光，而具受損膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌呈紅色熒光。兩者染料的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是480/500nm（SYTO 9）和 490/635nm（PI）。背景基本無(wú)熒光。本試劑盒兼容于熒光顯微鏡，熒光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測(cè)儀器。

產(chǎn)品組成：

【注】組分C熒光顯微鏡檢測(cè)方法中才會(huì)應(yīng)用的到，具體用法見(jiàn)注意事項(xiàng)3)。

試劑盒規(guī)格說(shuō)明（按照建議的試劑稀釋倍數(shù)和單次測(cè)試體積來(lái)計(jì)算）：保存與運(yùn)輸方法:-20℃避光保存，有效期一年。 冰袋運(yùn)輸。

熒光顯微鏡檢測(cè)：1ml菌液加入3μl染料混合液（SYTO 1.5μl +PI 1.5μl），可做40次獨(dú)立測(cè)試。

熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：2ml無(wú)菌水加入12μl染料混合液（SYTO 6.0μl +PI 6.0μl），制備成2×工作液。按照100μl染料混合液加入100μl菌液的比例使用，可做200次獨(dú)立測(cè)試。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)：2ml菌液加入6μl染料混合液（SYTO 3.0μl +PI 3.0μl），可做20次獨(dú)立測(cè)試。

使用方法(以下步驟僅用作示例以指導(dǎo)科研人員開(kāi)展自身細(xì)菌樣本的染色。)

一、培養(yǎng)條件和細(xì)菌懸液的制備：

【注意】：用本試劑盒進(jìn)行細(xì)菌染色，務(wù)必要小心去除培養(yǎng)基殘留，因?yàn)椋怂岷推渌囵B(yǎng)基成分可能以不可預(yù)料的方式與SYTO 9和PI結(jié)合，導(dǎo)致染色結(jié)果發(fā)生不可接受的變動(dòng)。簡(jiǎn)單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內(nèi)含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。

1.1 用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。

1.2 于10000×g離心10-15min，濃縮25ml細(xì)菌培養(yǎng)物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液來(lái)重懸沉淀。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液的30-40ml離心管（設(shè)置為活細(xì)菌組），用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細(xì)菌）的30-40ml離心管（設(shè)置為死細(xì)菌組）。

1.5 兩管樣品（分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組）于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品（分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組）于10000×g離心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸兩管樣品。

1.9 分別取3ml菌液測(cè)定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。

1.10 對(duì)于大腸桿菌或Staphylococcus aureus的建議染色濃度，根據(jù)你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經(jīng)、熒光酶標(biāo)儀）或流式細(xì)胞儀來(lái)參考相應(yīng)部分的染色條件。

二、染色條件的優(yōu)化：

試劑盒內(nèi)的兩種染料都經(jīng)過(guò)平衡優(yōu)化，按照1：1的比例進(jìn)行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細(xì)菌。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。比如：在待檢樣本中，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度，要么提高PI濃度。

為了全面優(yōu)化染色條件，建議測(cè)試梯度濃度的SYTO 9，每一種濃度與梯度濃度的PI進(jìn)行組合染色。建議按照1ml細(xì)菌懸液加入3µl不同混合比率的染料預(yù)混液。

[注]：SYTO 9 +PI 對(duì)細(xì)菌的染色請(qǐng)按照說(shuō)明書建議的15min來(lái)操作，不要超過(guò)30min。 SYTO 9有很好的細(xì)菌滲透性，我們給的實(shí)驗(yàn)條件都是優(yōu)化過(guò)。 SYTO 9只有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色，可能會(huì)延長(zhǎng)染色時(shí)間到120min。

由于染的是活菌+死菌的比例，請(qǐng)染色后盡快觀察，不要超過(guò)1h。 另，染色后基本是不用清洗的，除非覺(jué)得背景熒光很高，就是非細(xì)菌的菌體部分都能看到熒光，才有必要簡(jiǎn)單清洗一次。

三、熒光顯微鏡操作步驟：

活菌和死菌的熒光可能用標(biāo)準(zhǔn)的熒光素長(zhǎng)通濾片設(shè)置來(lái)同時(shí)觀察。替代方案的話，活菌（綠色熒光）和死菌（紅色熒光）可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設(shè)置。用于本試劑盒檢測(cè)的建議熒光顯微鏡濾片設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 適用于本試劑盒檢測(cè)用的常見(jiàn)濾光片特征：

3.1 在微量離心管內(nèi)組合等量的組分A（SYTO 9）和組分B（PI），混勻。

3.2 每1ml細(xì)菌懸液內(nèi)加入3μl染料預(yù)混液。按照建議的稀釋倍數(shù)，最終得到的染色工作液內(nèi)含0.3% DMSO。更高濃度的DMSO可能對(duì)染色產(chǎn)生副效果。

3.3 混勻后室溫避光孵育15min。

3.4 吸5μl染色的細(xì)菌懸液到載玻片上，并蓋上18mm方形蓋玻片。

3.5 根據(jù)表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來(lái)觀察。

四、熒光光度計(jì)操作步驟：

4.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個(gè)細(xì)菌/ml（~0.03 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為1×107個(gè)細(xì)菌/ml（~0.15 OD670）。用于熒光光度計(jì)檢測(cè)，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

4.2 參考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液。每個(gè)樣本的總體積為3ml。

4.3 在微量離心管內(nèi)分別加30μl組分A（SYTO 9）和30μl組分B（PI），混勻。

4.4 每組不同比例的細(xì)菌懸液內(nèi)加入9μl染料預(yù)混液（5個(gè)樣本×9μl =45μl總量），用槍上下吹打數(shù)次使其混勻。

4.5 室溫避光孵育15min。

4.6 熒光測(cè)定和數(shù)據(jù)分析：

①用熒光光度計(jì)測(cè)定每組細(xì)菌懸液（Fcell）的熒光發(fā)射光譜（激發(fā)：470nm，發(fā)射：490-700nm）

②分別測(cè)定發(fā)射光譜在510-540nm（em1，綠色）和620-650nm（em2，紅色）的累積熒光，并計(jì)算累積熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo)，以累積綠色熒光與紅色熒光比（RatioG/R）為縱坐標(biāo)，制圖

五、熒光酶標(biāo)儀操作步驟：

針對(duì)細(xì)菌懸液，用熒光酶標(biāo)儀的測(cè)定條件與熒光光度計(jì)的基本類似。如同熒光光度計(jì)的檢測(cè)步驟，染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度，綠/紅熒光比與活細(xì)菌相對(duì)數(shù)量呈正比。

5.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為2×108個(gè)細(xì)菌/ml（~0.06 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為2×107個(gè)細(xì)菌/ml（~0.3 OD670）。用于熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

5.2 參考表3在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液（大腸桿菌或Staphylococcus aureus）。每個(gè)樣本的總體積為2ml。

5.3 在微量離心管內(nèi)分別加6μl組分A（SYTO 9）和6μl組分B（PI），混勻。

5.4 通過(guò)將所有的12μl上述預(yù)混液加入2ml無(wú)菌的dH2O，混勻后制備2×染色混合液。

5.5 吸100μl細(xì)菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內(nèi)，建議每個(gè)制備物做三個(gè)平行。96孔板的邊緣孔通常空置以避免假讀數(shù)。

5.6 更換新的槍頭，每孔加入100μl 2×染色混合液，上下吹打使充分混勻。

5.7 室溫避光孵育15min。

5.8 熒光測(cè)定和數(shù)據(jù)分析：

①以~485nm為激發(fā)波長(zhǎng)，~530nm為發(fā)射波長(zhǎng)（emission 1，綠色）來(lái)測(cè)定每孔熒光

②以~485nm為激發(fā)波長(zhǎng)，~630nm為發(fā)射波長(zhǎng)（emission 2，紅色）來(lái)測(cè)定每孔熒光

③通過(guò)測(cè)定兩種發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)光，并計(jì)算熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo)，以RatioG/R為縱坐標(biāo)，制圖

六、流式細(xì)胞儀操作步驟：

儀器的檢測(cè)配置可能要因?qū)嶋H情況來(lái)調(diào)整，但此處列出的檢測(cè)技術(shù)和設(shè)置參數(shù)適用于市場(chǎng)上絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀。

6.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個(gè)細(xì)菌/ml（~0.03 OD670），之后用無(wú)菌dH2O稀釋100倍使其最終密度為1×106個(gè)細(xì)菌/ml。

6.2 參考表4在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混11種不同比例的細(xì)菌懸液。每個(gè)樣本的總體積為2ml。

注意事項(xiàng)：

1由于試劑盒內(nèi)SYTO 9和PI的組分量少，室溫回溫充分融化后，務(wù)必低速離心沉至管底后再開(kāi)蓋。

2兩款探針溶液本身就是溶于DMSO中，所以后續(xù)無(wú)需再單獨(dú)添加，第一次使用可將SYTO 9和PI根據(jù)單次用量分裝保存，密封后置于≤-20℃避光保存。

3組分C（Mounting oil）主要應(yīng)用于熒光顯微鏡檢測(cè)法，菌液加到載玻片后，接著滴1-2滴組分C用于將細(xì)菌固定在膜上,25℃的折射率是517 ± 0.003。不要用作浸油（Immersion oil）。

4SYTO 9和PI結(jié)合核酸，PI是潛在的誘變劑，目前沒(méi)有數(shù)據(jù)闡明SYTO 9的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當(dāng)防護(hù)。DMSO能促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。強(qiáng)烈建議處理DMSO儲(chǔ)存液時(shí)戴雙層手套。對(duì)于核酸染料，含此類染料的試劑經(jīng)活性炭吸附后再進(jìn)行廢液處理。活性炭之后經(jīng)焚燒來(lái)破壞染料。

5為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。